Separace velmi polárních látek a strukturně podobných analytů na RP-HPLC

18. 3. 2016
V tradičním systému s reverzní fází (RP) se retence zvyšuje s rostoucí hydrofobicitou analytu. Děje se tak díky rostoucím interakcím mezi analytem a stacionární fází. Naopak s rostoucí polaritou analytu se stává dominantní interakce analyt-mobilní fáze a retence klesá. Separovat velmi polární látky pomocí kapalinové chromatografie s reverzní fází je náročné a problematické. Metody vyžadují mnoho kompromisů (slabá retence, nízké rozlišení) a omezení (výběr mobilní fáze a pufrů). Nabízí se použití HILIC separace, nejlepším a nejjednodušším řešením je ale porézní grafitizovaný uhlík – unikátní kolona Thermo Scientific Hypercarb .

Obr. 1 Vliv složení mobilní fáze na retenci uracilu u kolon HILIC a Hypercarb

Obr. 2 Ukázka separace látek s různou polaritou na koloně Hypercarb

Hypercarb poskytuje výjimečně silnou retenci velmi polárních látek a navíc je schopen separovat strukturně podobné analyty. Toto chování vysvětlují hydrofobní a elektrostatické retenční mechanismy.
Hypercarb je 100% porézní grafitizovaný uhlík (PGC). Na molekulární úrovni je povrch grafitu plochý a vysoce krystalický na rozdíl od členitého povrchu silikagelu s vázanou fází a zbytkovými silanoly.V důsledku toho je mechanismus interakcí na PGC zcela odlišný. Celková retence na Hypercarbu je kombinací dvou mechanismů: 1, hydrofobní interakce se stacionární fází, kdy s rostoucí hydrofobicitou analytů roste retence 2, nábojem indukovaná interakce mezi polárním analytem a polarizovatelným povrchem grafitu.

Obr. 3 Vliv tvaru analytu na sílu interakce s povrchem grafitu a, dobré přiklonění rovinné molekuly k povrchu grafitu b, slabé přiklonění molekuly k povrchu grafitu

Obr. 4: Schematické znázornění retence polárních látek, kdy se k povrchu grafitu přiblíží a, kladný náboj b, záporný náboj, což vede k vytvoření nábojem indukovaného dipólu na povrchu grafitu

Polarizovatelnost povrchu grafitu je klíčem k pochopení mechanismu retence polárních látek na jeho povrchu.
Síla interakce závisí na velikosti plochy molekuly, která se dostane do kontaktu s povrchem grafitu a na typu a umístění funkčních skupin v místě kontaktu s plochým grafitovým povrchem. Čím více je molekula analytu rovinná, tím těsnější bude její přiklonění k povrchu grafitu a tím vznikne více možných míst pro interakci – tedy maximální retence. Retence se snižuje u vysoce rozvětvených, 3-dimenzionálních a pevných molekul, u nichž je v kontaktu s grafitem jen malá část jejich povrchu v porovnání s rovinnými molekulami se stejnou molekulovou hmotností.

Díky těmto unikátním vlastnostem jsou kolony Hypercarb excelentní v separacích vysoce polárních látek, jako jsou sacharidy a látky s několika hydroxylovými, karboxylovými nebo amino skupinami:

Částice Hypercarbu jsou sférické a plně porézní bez chemicky vázané fáze. Kolony jsou díky tomu naprosto stabilní v celém rozmezí pH 0-14 a nejsou náchylné k agresivním mobilním fázím. Robustní povaha tohoto materiálu mu poskytuje výjimečnou životnost. Díky své stabilitě a tomu, že struktura PGC nijak neomezuje výběr mobilních fází, je vhodný pro LC/MS aplikace. Pro zvýšení rychlosti analýz je možné rutinní používání vyšších teplot až do 200 °C bez ztráty účinnosti. Snížení zpětného tlaku umožní použití delších kolon s menší velikostí částic a dosažení ještě lepšího rozlišení složitých směsí.
Hypercarb má jako stacionární fáze v HPLC unikátní vlastnosti. Jeho selektivita se liší od selektivity silikagelových nebo polymerních kolon, jelikož chemické vlastnosti jeho povrchu a retenční mechanismy jsou zcela odlišné. K nepolárním látkám se chová jako silikagel s vázaným alkylem a velmi silnou retencí, nicméně retence a selektivita pro polární látky a strukturně podobné analyty je velmi odlišná. Porézní grafitizovaný uhlík poskytuje excelentní retenci a separaci velmi polárních látek a jeho povrch je stereo-selektivní se schopností separovat geometrické izomery, diastereoizomery a další strukturně podobné analyty. Jeho kompatibilita se všemi typy mobilních fází umožňuje separaci látek se širokou škálou polarit během jedné analýzy a přináší obrovské separační možnosti.

Více o kolonách pro kapalinovou chromatografii naleznete zde .