CYTOQUBE: Vysokokapacitní 3D fluorescenční zobrazování a analýza nádorových sféroidů

Nová éra rychlosti a efektivity v in vitro testování léčiv.

Tradiční metody vývoje léčiv se dlouhodobě opíraly o 2D buněčné kultury, které jsou však v porovnání s reálným biologickým prostředím omezené. 3D kultury, jako jsou sféroidy, sice nabízejí fyziologicky relevantnější modely, ale jejich masové nasazení brzdila nízká rychlost sběru dat. Skenování 96-jamkové destičky se třemi fluorescenčními značkami pomocí konvenčních metod běžně přesahuje 60 minut. Systém CYTOQUBE® tento časový limit překonává kombinací unikátní optiky „light-sheet“ a inteligentního softwaru, čímž činí z 3D kultur reálný standard pro moderní výzkum léčiv.

TECHNOLOGIE LIGHT-SHEET: RYCHLOST A ŠETRNOST

Základem systému CYTOQUBE je mikrodestičkový cytometr využívající technologii světelného řezu (light-sheet). Na rozdíl od tradiční širokoúhlé fluorescence nebo bodového laserového skenování poskytuje tato technika rychlé a šetrné optické řezy vzorkem.

Díky tomu dochází k:

• Minimalizaci fototoxicity a fotobleachingu: Světelný řez prochází pouze sledovanou rovinou XZ, což chrání zbytek živého vzorku.
• Dramatickému zrychlení akvizice: Zatímco běžné konfokální systémy musí vzorek skenovat ve třech osách (X-Y-Z), CYTOQUBE provádí plynulý sken v jedné ose, během kterého kamera zachycuje XZ snímky všech buněk v jamce.

Obr. 1: Plně automatizovaný mikrodestičkový cytometr CYTOQUBE

PLNĚ AUTOMATIZOVANÉ 3D ZOBRAZENÍ
V systému CYTOQUBE vytváří optika světelný řez o šířce odpovídající jedné jamce 96jamkové destičky. Při pohybu destičky skenerem software automaticky integruje jednotlivé snímky do 3D tomografického obrazu celé jamky. Zařízení je navrženo pro práci s formáty mikrodestiček s 96, 384 i 1536 jamkami.

KVANTITATIVNÍ ANALÝZA MORFOLOGIE A VIABILITY
Klíčovým přínosem je schopnost systému provádět paralelní zpracování skenu a analýzy. To znamená, že kvantitativní výsledky morfologie a intenzity fluorescence jsou k dispozici současně s pořízením obrazu.

Mezi parametry, které systém automaticky vyhodnocuje u každého jednotlivého sféroidu, patří:

• Rozpoznání buněk v celém 3D objemu.
• Jas fluorescence, který slouží k určení viability a metabolického stavu.
• Morfologické charakteristiky, jako je tvar a velikost sféroidu.
  
  

EXPERIMENT:

VLIV CYTOTOXICKÝCH LÁTEK

Schopnosti systému byly demonstrovány na experimentu s rakovinnými sféroidy kultivovanými v Matrigelu. Sféroidy byly vystaveny působení látek LY294002 a Menadione. Po 24hodinové inkubaci a následném obarvení fluorescenčními barvivy systém CYTOQUBE v reálném čase kvantifikoval dopady těchto látek na populaci buněk.

Obr. 3:Fluorescenční snímek 96jamkové mikrodestičky 24 hodin po přidání látek LY294002 nebo Menadionu (maximální projekce 3D obrazu)

Obr. 4:Reprezentativní 3D fluorescenční snímky zobrazující Control v čase 0 h (a), kontrolu po 24 hodinách (b), 100 µmol/l LY294002 po 24 hodinách (c) a 100 µmol/l Menadionu po 24 hodinách (d)

Obr. 5: Viabilita buněk a morfologické změny ve sféroidech (souhrn ze 48 jamek)

Měřicí workflow zahrnuje nastavení, samotný sken a následnou analýzu dat, která umožňuje rychlou extrakci tzv. „hit-well“ a generování grafických výstupů. Celý proces je optimalizován pro hloubku vzorku od 200 μm do 400 μm.

ZÁVĚR - PRECIZNÍ 3D ANALÝZA V REÁLNÉM ČASE

Výsledky experimentu potvrdily, že systém CYTOQUBE představuje vysoce efektivní nástroj pro kvantitativní hodnocení účinků farmakologických látek na komplexní 3D modely. Detailní analýza ukázala, že zatímco na začátku experimentu (0 h) byly sféroidy v kontrolní skupině téměř dokonale kulovité, po 24 hodinách kultivace vykazovaly přirozené zploštění, přičemž většina buněk zůstala vitální.

Při testování specifických látek systém jasně rozlišil různé mechanismy jejich působení:

• Inhibitor LY294002 (100 µmol/l): Po 24 hodinách došlo k mírnému snížení tloušťky sféroidů, avšak většina buněk si zachovala svou viabilitu.
• Cytotoxický Menadion (100 µmol/l): Vyvolal masivní buněčnou smrt patrnou v celém objemu sféroidu, což bylo přesně kvantifikováno díky fluorescenčnímu značení propidium jodidem.

Klíčovým přínosem systému CYTOQUBE je jeho rychlost a vysoká průchodnost. Schopnost pořídit 3D fluorescenční snímky a současně provést jejich analýzu u 10 sloupců 96jamkové destičky ve třech barevných kanálech během přibližně 10 minut odstraňuje dosavadní technologický bottleneck farmaceutického screeningu. Tato technologie tak umožňuje transformovat 3D buněčné modely z čistě výzkumných nástrojů na standardní součást vysokokapacitního vývoje nových léčiv a testování toxicity.