28. 1. 2021

V minulém roce spatřila světlo světa nová revoluční konfokální platforma STELLARIS. Po řadě let nahradila úspěšnou platformu Leica TCS SP8, která vynikla především díky jednoduchosti použití a unikátním vlastnostem. Leica STELLARIS předchozí platformu předčí hned v několika ohledech, které si postupně představíme v několika dílném seriálu. První díl je věnovaný způsobu detekce a novým detektorům.

Způsob detekce

U platformy STELLARIS je zachován zcela unikátní způsob detekce, na místo dichroických zrcadel (čím více dichroických zrcadel, tím nižší propustnost celého systému) pro navázání několika laserů, je použit programovatelný krystal s názvem AOBS (Acousto Optical Beamsplitter). Tento krystal umožňuje navázat až 8 vlnových délek současně bez nutnosti přídavných filtrů. Další výraznou výhodou je zřetelně lepší spektrální charakter pro emisní část. O této výhodě v dalším díle.

Leica je ve způsobu rozložení detektorů a generování signálu unikátní. Proč takové rozložení detektorů? Odpověď je jednoduchá, signál se rozkládá přes krystal, který generuje celé spektrum, následně míří do prvního detektoru, kterým lze vybrat jakoukoliv oblast pro detekci. Žádný signál není ztracen, díky vysoce reflexním spektrálním zrcadlům je odražen na další detektor a opět si lze vybrat spektrum, které je potřeba. Situace se opakuje až do pátého detektoru, jak je zobrazeno na obr. 1.

Obr. 1 - generování signálu pomocí hranolu a spektrální detekce

Jednotlivé detektory lze hardwarově nastavit přesně pro dané spektrum a získat tak maximum signálu. Detektor umí využít všechny informace (emisní spektrum daného fluoroforu) a dynamický rozsah, některé i lifetime a pak optimálně nastavit - viz obr. 2. Pro takové rozložení se neztratí žádný foton!

Obr. 2 – ukázka použití jednotlivých detektorů a hardwarové oddělení emisních spekter

Celkové schéma zapojení systému STELLARIS je zobrazeno na obr. 3. Je možné připojit velké množství laserových zdrojů, ale o nich budeme psát v dalším díle seriálu. Jsou uvedeny dva klíčové prvky AOBS a spektrální detekce. To vše nám v tomto díle postačí, abychom si řekli o nových detektorech systému STELLARIS.

Obr. 3 – skenovací jednotka systému STELLARIS8

Technologie nových detektorů

V novém systému se objevili hned tři nové typy detektorů rodiny Power HyD. Detektor Power HyD S má nejvyšší dynamický rozsah a velice široké pokrytí spektra ze všech detektorů. Tento detektor je vhodný pro téměř všechny konfokální aplikace. Power HyD R detektor je speciálně upravený pro snímání spektra v NIR oblasti až do 850 nm. Je vhodný především pro dlouhodobé experimenty. Poslední z řady je Power HyD X detektor, který je optimální pro lifetime aplikace a především pro FLIM, FCS.

Power HyD S detektor je odlišný. Tvoří základ STELLARIS systému. Základem je silicon based multi-pixel photon counter (MPCC), který používá multi-cell architekturu a principu lavinové photodiody pro vyčítání signálu pro odstranění šumu a zlepšení efektivity sbírání jednotlivých fotonů. Tento detektor lze přepnout z analogového modu do photon counting módu. Díky této vlastnosti je použití tohoto detektoru pro velmi široké spektrum konfokálních aplikací. Pro photon counting mód jsou odlišeny jednotlivé fotony s vysokou přesností a kvantifikovatelnými daty. U druhého analogového módu je signál integrován přes čas, což má za následek vysoký dynamický rozsah. Princip je zobrazen na obr. 4. Oba další typy detektorů jsou založeny na principu lavinové fotodiody, kde se signál urychluje vysokým napětím a přes ultra senzitivní GAsP vrstvu se generují jednotlivé fotony bez dodatečného šumu. Jedná se o jeden z nejrychlejších detektorů s možností použití pro FLIM, FCS metody.

Obr. 4 Nová řada detektorů pro STELLARIS včetně principu generování signálu: Power HyD S, HyD X a HyD R

Každý foton se počítá!

Dynamický rozsah detektoru určuje, kolik různých stupňů intenzity lze sledovat ve vašem obrázku. Vysoký dynamický rozsah je nezbytný pro zobrazení heterogenních intenzit signálu a velkých fluktuací cílových molekul běžných v biologických aplikacích. Power HyD S technologie poskytuje více jak dvojnásobek dynamického rozsahu než klasické photon counting metody. Tato schopnost zlepšuje kontrast obrazu, zejména při vysokých intenzitách signálu, kde je mnohem větší pravděpodobnost překrývajících se fotonů. Tradiční metody a detektory PMT, či GAsP PMT pro počítání fotonů nelze přesně zaznamenat 2 rychlé příchozí fotony za sebou viz obr. 5. Power counting mód díky velmi přesné analýze šířky pulzů a počítání energie tuto vlastnost tradičních detektorů umožní.

Obr. 5 - Rozdíl konvenčních detektorů a power counting detektorů

Ukázka a porovnání Power counting módu je zobrazeno na obr. 6. Vždy konvenční photon counting a power counting. Preparát jsou fixované HeLa buňky značené WGA-405 (HyD S), aTubulin-AF555 (HyD X) a aTom20-AF750 (HyD R).

Obr. 6 – Ukázka srovnání pro fixované HeLa buňky

Vylepšený výkon v celém spektru

Ať jsou vaše preferované fluorescenční značky jakékoli, citlivost detektorů může být kritická. Jedná se především o vysvěcování (photobleaching, photodemage) a získání maximálního signálu především pro live-cell aplikace. STELLARIS s rodinou Power HyD je schopen nabídnout vylepšené detekční schopnosti v celém spektru. Jádra detektorů Power HyD S dosahují (PDE) až 56 %, což je více než dvojnásobek oproti konvenční multi-alkáli detektorům tzn. fotonásobiče (PMT). Tato ultra citlivá detekce je pro téměř celý rozsah běžně používaných fluoroforů jako například CFP nebo GFP. Detektory Power HyD S také poskytují dobrou citlivost do červené, a dokonce i do blízké (NIR) infračervené spektrální oblasti. Systém STELLARIS8 pak nabízí libovolnou kombinací detektorů Power HyD S, HyD R a HyD X a umožňující nejširší škálu aplikací viz obr. 7.

Obr. 7 – Spektrum pro jednotlivé detektory rodiny Power HyD

Jaký detektor použít?

Nevíte si rady, jaký detektor použít? Volte Power HyD S či si vyberte metodu, kterou potřebujete. Pokud stále nevíte kontaktuje nás, rádi Vám poradíme. Srovnávací tabulka je zobrazen na obr. 8.

Obr. 8 – Metody a použití jednotlivých detektorů pro systémy STELLARIS

Co bude v dalším díle?

V dalším díle se zaměříme na možnosti použití jednotlivých laserů. Také si řekneme něco více o AOBS a podíváme se na technologii TauSENSE.

Na něco jsme zapomněli? Něco není správně popsané, máte jakýkoliv dotaz, napište nám na kopecky@pragolab.cz