Orbitrap Astral - hvězdný hmotnostní spektrometr

Když letos uvedla společnost Thermo Fisher Scientific nový hmotnostní spektrometr Orbitrap Astral, všem bylo jasné, že jde o jeden z nejvýznamnějších pokroků v oblasti hmotnostní spektrometrie za poslední desetiletí. Díky značné poptávce v proteomických, metabolomických a lipidomických (nazývané jako „omics“ či „omiky“) kruzích po instrumentu, který by s maximální rychlostí a velmi vysokým rozlišením identifikoval látky s extrémně odlišným koncentračním zastoupením (> 12 řádů), se poprvé zrodil nástroj s více vysoce rozlišujícími hmotnostními analyzátory fungujícími synchronně a paralelně.

Obr. 1: Společnost Thermo Fisher Scientific se dlouhodobě profiluje jako korporace rozvíjející komplexní diagnostiku nemocí
a výzkum, výrobu a analýzu léčiv, zvláště biofarmak.

Thermo Fisher Scientific se dlouhodobě profiluje jako korporace rozvíjející komplexní diagnostiku nemocí a výzkum, výrobu a analýzu léčiv, zvláště biofarmak, čemuž napomáhá významná divize analytické instrumentace. Potřeby rozvoje této oblasti se odráží ve směrech pokroku analyzátorů, kde bezpochyby hraje prim hmotnostní spektrometrie s nepřekonatelnou orbitální pastí. Jednoznačně největší výzvou posledních let se staly potřeby proteomiky, metabolomiky a lipidomiky (na rozdíl od genetiky odráží aktuální stav živého organismu), tedy mohutně se rozvíjejících oblastí studia (analyticky řečeno) komplexních vzorků s extrémním počtem analytů ohromného koncentračního rozsahu. Nic složitějšího nelze vyžadovat, na druhou stranu vedle hmotnostní spektrometrie se žádná jiná technika neetablovala na úroveň, jež by takovou „směs“ charakterizovala stejně či lépe. Informace o počínající nemoci může být skryta jako jehlička v kupce sena v neznámém analytu na relativně nízké koncentrační úrovni koeluující z chromatografického systému spolu s dalšími stovkami látek. Jak nastavit systém, vyvinout metodu a aplikovat ji, aby nám neunikla?

Obr. 2: Hlavní oblasti rozvoje hmotnostní spektrometrie určující směr pokroku instrumentace.

Charakterizace organických látek se již dávno posunula od tradiční trojkombinace spektrometrií hmotnostní, nukleární magnetické rezonance a infračervené; díky složitosti směsí a tudíž nutnosti předřazení separační techniky se hmotnostní spektrometrie stala jedinou identifikační spektrometrií v omics problematice. Ani logický odklon od jednotkového rozlišení směrem k rozlišení vysokému (z čehož lze odvodit elementární složení analytu) ke strukturní analýze nestačí, musí být doplněno fragmentačním spektrem (MS/MS) identifikované molekuly, nejlépe pak též vysoce rozlišeným. V každém sekundovém chromatografickém okně nechť je změřeno jedno ultra-vysoce rozlišené spektrum (full scan, rozlišení > 200 000 FWHM) a u maxima detekovaných iontů pak MS/MS spektrum s rozlišením > 80 000 FWHM.

Obr. 3: Informace o počínající nemoci může být skryta jako jehlička v kupce sena v neznámém analytu na relativně nízké
koncentrační úrovni koeluující z chromatografického systému spolu s dalšími stovkami látek.

S podobným korporátním zadáním se zřejmě potýkal vynálezce orbitálních pastí Alexander Makarov se svým týmem a čelil tak výzvě, která měla posunout hranice hmotnostní spektrometrie. Z arzenálu dostupných a ve vývojových buňkách Thermo Fisher Scientific vylepšovaných hmotnostních analyzátorů (kvadrupól, lineární iontová past, orbitální iontová past a multireflexní time of flight, ozn. mrTOF) zvolil dvě možné paralelizace, a to 1) uspořádání kvadrupólu spolu se dvěma či více orbitálními iontovými pastmi nebo 2) uspořádání kvadrupólu s orbitální iontovou pastí a multireflexním time of flight analyzátorem. Obě varianty obsahují dva a více nezávislé vysoce rozlišující prvky, což pravděpodobně odstartovalo novou éru hmotnostní spektrometrie z pohledu instrumentace. Makarov pracoval (a pracuje) na obou verzích, nicméně komerční podobu (letos) vtiskl do varianty s multireflexním time of flight analyzátorem. S nešvarem standardních průletových analyzátorů se vypořádal brilantně: aby nedocházelo k iontovým aberacím - odchylkám v dráze iontů způsobujících ztrátu citlivosti - upravil paralelní iontová zrcadla na konvergující (ionty jsou nuceny na konci dráhy obrátit svůj směr; pozn.: lze využít pro nový typ elektrostatické pasti, viz obr. 7), které opatřil kompenzačními elektrodami usměrňujícími odchylky v ose z (kolmá na rovinu dráhy iontů) a implementoval nízkoztrátové iontové pasti pro akumulaci a koncentraci iontů před injektáží do mrTOF. Světlo světa tak spatřila unikátní hybridní instrumentace se dvěma vysoce rozlišujícími analyzátory – orbitální pastí dosahující rozlišení až 480 000 FWHM a bezztrátovým multireflexním průletovým analyzátorem s rozlišením 80 000 FWHM (pro MS/HRMS spektra) a frekvencí sběru dat 200 spekter za sekundu. Zatímco jeden balík iontů podléhá detekci v orbitální iontové pasti, paralelně s tím další balík iontů sekvenčně podléhá fragmentaci, další akumulaci, další čeká na injektáž do mrTOF a konečně poslední prolétá mimořádným multiodrazovým aparátem.

Obr. 4: Požadavku akvizice jednoho ultra-vysoce rozlišeného spektra (full scan, rozlišení > 200 000 FWHM) a u maxima detekovaných iontů změření MS/MS spektra s rozlišením > 80 000 FWHM v každém sekundovém chromatografickém okně může vyhovět jen uspořádání C a D. (A – lineární uspořádání kvadrupólu Q a orbitrapu OT, kdy je HRMS a MS/HRMS měřeno v sérii; B – paralelní uspořádání kvadrupól Q – orbitrap OT a lineární iontové pasti LIT charakteristické pro tribridy; C a D – paralelní uspořádání kvadrupólu Q, orbitrapu OT a dalšího orbitrapu OT či time of flight analyzátoru TOF patentováno A. Makarovem).

Unikátní technologie použitá v novém hmotnostním spektrometru oslňuje dechberoucí výkonností; pomocí Orbitrap Astral lze ve stejném vzorku za stejný čas identifikovat o 50 % více proteinových skupin oproti současně nejlepšímu dostupnému instrumentu. První výsledky z laboratoří navíc ukazují, že se díky „hvězdnému“ nástroji budou zcela jistě posouvat i hranice ve výzkumu závažných onemocnění a možnostech jejich léčby. Díky všem, kteří se o to snažili a snaží, a nechť je nadále povzbuzuje latinské rčení per aspera ad ASTRA (přes překážky ke vznešeným cílům).

Obr. 5: Standardní mrTOF nevyhovující původnímu zadání (vlevo) musel být upraven tak, aby nedocházelo k iontovým aberacím - odchylkám v dráze iontů způsobujících ztrátu citlivosti - 1) úpravou paralelních iontových zrcadel na konvergující (vpravo nahoře), které jsou opatřeny kompenzačními elektrodami usměrňujícími odchylky v ose z (kolmá na rovinu dráhy iontů) a 2) implementací nízkoztrátových iontových pastí pro akumulaci, koncentraci iontů před injektáží do mrTOF (vpravo dole) dle patentu US 9136101 B2. 15.9.2015 a US 10964520 B2. 30.3.2021.

Obr. 6: Znázornění trajektorie iontů mezi zrcadly, jejichž odchylky jsou korigovány kompenzačními elektrodami (tvar kompenzačních elektrod je odvozenou funkcí tvaru zakřivení iontových zrcadel) dle patentu US 9136101 B2. 15.9.2015 a US 10964520 B2. 30.3.2021. 

Obr. 7: Potenciál bezztrátového mrTOF pro vývoj nového typu elektrostatické pasti patentované Makarovem dle US 9136101 B2. 15.9.2015 (vlevo); Alexander Makarov byl fascinován elektrostatickými pastmi již v 80. letech minulého století. 

Obr. 8: Zatímco jeden balík iontů je detekován v orbitální iontové pasti, paralelně s tím další balík iontů sekvenčně podléhá
fragmentaci, další akumulaci, další čeká na injektáž do mrTOF a konečně poslední prolétá unikátním multiodrazovým aparátem.

Obr. 9: Srovnání počtu identifikací proteinových skupin pomocí současného high-end instrumentu (šedivě)
a s novým Orbitrap Astral (barevně) za různý čas chromatografické separace.

Obr. 10: Rodina současných zástupců hmotnostních spektrometrů s orbitální pastí.

Pro více informací kontaktujte Lukáše Plačka: placek@pragolab.cz nebo +420 733 656 164.

Tým Pragolab s.r.o.